15.17. XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI

 

Hiệu giá huyết thanh kháng dại được xác định dựa trên nguyên lý của phản ứng trung hòa in vivo của một liều cố định virus dại thử thách với các độ pha loãng khác nhau của huyết thanh kháng dại.

 

Xác định hiệu giá của virus thử thách

Chủng virus dại thử thách được dùng trong thử nghiệm xác định hiệu giá của huyết thanh kháng dại là chủng CVS (Challenge virus strain), được giữ ở dạng hỗn dịch 20% não, bảo quản -70^OC.

Làm tan băng nhanh ống đựng chủng virus dại thử thách dưới vòi nước chảy.

Pha loãng bậc 10 với dung dịch huyết thanh ngựa thường 2% (đã được bất hoạt 30 phút ở 56^OC) để có nồng độ từ 2x10^-2, 2x10^-3 ....đến 2x10^-9.

Trong một dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 0,5 ml hỗn dịch virus của mỗi độ pha loãng, từ 2x10^-4 đến 2x10^-9 và 0,5 ml dung dịch huyết thanh ngựa thường 20%.

Lắc đều các ống, để yên ở 37 ^OC trong 90 phút.

Tiêm 0,03 ml vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột có trọng lượng 14-16 g/con cho mỗi độ pha. Các ống chủng được giữ trong nước đá trong suốt quá trình tiêm.

Theo dõi và ghi chép số chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.

Tính LD₅₀ theo Spearman - Kaber.

 

Xác định hiệu giá huyết thanh kháng dại

Pha loãng huyết thanh kháng dại chuẩn quốc tế, huyết thanh kháng dại thử nghiệm và trung hoà với virut thử thách:

Pha huyết thanh kháng dại chuẩn quốc tế với nước muối sinh lý để có dung dịch huyết thanh kháng dại chuẩn chứa 10 đơn vị quốc tế (IU)/ml.

Pha huyết thanh kháng dại thử nghiệm với nước muối sinh lý để có dung dịch huyết thanh kháng dại thử  nghiệm  chứa  khoảng 10 IU/ml.

Pha loãng bậc 5 hai dung dịch trên với dung dịch huyết thanh ngựa thường 2% để có các độ pha 1/5; 1/25; 1/125; 1/625 và 1/3125.

Pha hỗn dịch virus thử thách đã biết hiệu giá để có 200 LD₅₀/0,03ml.

Trong một dãy các ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống : 0,5 ml huyết thanh kháng dại ở mỗi độ pha loãng và 0,5 ml hỗn dịch virus thử thách có chứa 200 LD₅₀/0,03ml.

Lắc đều các ống nghiệm và để yên ở 37 ⁰C trong 90 phút.

Giữ các ống trong nước đá trong suốt quá trình tiêm.

Tiêm 0,03 ml  vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột  có trọng lượng 14-16g cho mỗi độ pha của kháng huyết thanh.

Theo dõi và ghi chép số chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.

Xác định số LD₅₀ của chủng virus dại trong thử nghiệm (nhóm chứng):

Từ hỗn dịch virus pha để trung hoà  có chứa 200 LD₅₀/0,03 ml đã nêu ở trên, được xem là 10⁰ để từ đó pha loãng bậc 10 thành 3 độ pha 10^-1; 10^-2 và 10^-3.

Trong một dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống : 0,5 ml hỗn dịch virus từ mỗi độ pha  và 0,5 ml dung dịch huyết thanh ngựa thường 20%

Lắc đều các ống nghiệm và để yên ở 37⁰C trong 90 phút.

Giữ các ống trong nước đá.

Tiêm 0,03 ml  vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột  có trọng lượng 14-16g cho mỗi độ pha của hỗn dịch virus dại.

Theo dõi và ghi chép số chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.

Tính LD₅₀ theo bảng Spearman - Kaber.

Tính kết quả

Thử nghiệm chỉ có giá trị khi số LD₅₀ để trung hoà huyết thanh kháng dại là 100-300 LD₅₀ trong 0,03 ml.

Tính ED₅₀ của huyết thanh kháng dại theo phương pháp Spearman - Kaber.

Hiệu giá của huyết thanh kháng dại được tính ra đơn vị quốc tế  trong 1 ml  và bằng:

              Anti log (ED₅₀ HT chuẩn qt : ED₅₀ HT thử nghiệm) x 2 x N

Trong đó:

2: Số IU có trong 1 ml huyết thanh kháng dại  chuẩn quốc tế dùng trong thử nghiệm.

N: Số lần pha loãng huyết thanh kháng dại thử nghiệm.